Análisis de PCR detecta y diferencia las especies de Coccidioides

La coccidioidomicosis (fiebre del valle) es una enfermedad fúngica pulmonar y sistémica con una incidencia creciente y áreas endémicas en expansión. La diferenciación de los agentes etiológicos Coccidioides immitis y C. posadasii es problemática en los laboratorios clínicos, ya que los esquemas de tipificación por satélite y PCR convencional son difíciles.

Los signos y síntomas notables de la coccidioidomicosis incluyen una profunda sensación de cansancio, pérdida del olfato y del gusto, fiebre, tos, dolores de cabeza, sarpullido, dolor muscular y dolor articular. La fatiga puede persistir durante muchos meses después de la infección inicial. La tríada clásica de coccidioidomicosis conocida como “reumatismo del desierto” incluye la combinación de fiebre, dolores articulares y eritema nudoso.

Los micólogos del Centro Wadsworth (Nueva York, NY, EUA) y sus colegas, analizaron 217 aislados sospechosos de especies de Coccidioides, 10 tejidos fijados en formol e incluidos en parafina, tres viales de riñón de mono rhesus, seis muestras de tejido pulmonar, tres líquidos cefalorraquídeos (LCR), dos médulas óseas, un líquido pleural y una muestra de sangre total. También se incluyeron en el estudio diecisiete aislamientos de C. immitis y 15 de líquido cefalorraquídeo y líquido pleural, que dieron positivo para coccidioidomicosis por inmunodifusión y fijación del complemento.

Los científicos utilizaron el mini kit de ADN de Qiagen en el extractor automático QIAcube (Qiagen, Venlo, Países Bajos), para la extracción de ADN a partir de todos los tipos de muestras. Se utilizó una modificación de la PCR diagnóstica convencional. El gen PRA2 y el contig Ci41815/Cp45809 fueron utilizados para diseñar el ensayo de PCR dúplex en tiempo real. La especificidad del ensayo se evaluó mediante el uso de un extenso panel de ADN que comprende varios hongos relacionados cercana y lejanamente con Coccidioides spp. y pocos patógenos bacterianos principalmente responsables de causar infección pulmonar. El equipo desarrolló sondas TaqMan marcadas con Cy5 y FAM para el ensayo de PCR dúplex en tiempo real con el fin de realizar una diferenciación rápida de C. immitis y C. posadasii a partir de cultivos y muestras clínicas.

Los investigadores informaron que el análisis era muy sensible con un límite de detección de 0,1 pg de reacción de ADNg/PCR, lo que equivalía a aproximadamente diez copias del genoma de C. immitis o C. posadasii. El ensayo fue muy específico sin reactividad cruzada con la amplia gama de patógenos fúngicos y bacterianos. El análisis retrospectivo de los aislamientos de hongos y los especímenes primarios presentados entre 1995 y 2020 confirmó 168 aislamientos y cuatro especímenes primarios como C. posadasii y 30 aislamientos como C. immitis de casos de coccidioidomicosis humana, mientras que las ocho muestras primarias de dos animales (mono rhesus y rinoceronte) fueron confirmados como C. posadasii. Un análisis preliminar de muestras de líquido cefalorraquídeo (LCR) y líquido pleural mostró una correlación positiva entre las pruebas serológicas y la PCR en tiempo real para dos de las 15 muestras.

Los autores concluyeron que su análisis de diagnóstico de PCR convencional, modificado, era excelente para la identificación de cultivos de C. immitis y C. posadasii y que el nuevo ensayo de PCR en tiempo real dúplex tenía una utilidad más amplia para identificar dos especies de Coccidioides a partir de cultivos y muestras primarias. El PCR dúplex en tiempo real para Coccidioides spp. permitirá una rápida diferenciación de C. immitis y C. posadasii de las muestras clínicas y aumentará aún más el tratamiento y la vigilancia de la coccidioidomicosis. El estudio fue publicado el 16 de septiembre de 2021 en la revista PLOS Neglected Tropical Diseases.

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Centro Wadsworth