Dos métodos simples preparan ADN adecuado para la PCR digital

Aunque se puede preparar fácilmente ADN de alta calidad a partir de células cultivadas con kits disponibles comercialmente, muchos estudios involucran una gran cantidad de muestras, lo que aumenta drásticamente el costo.

Además, una cantidad limitada de cada muestra suele ser un desafío, por ejemplo, para estudios que utilizan células de cultivos primarios para probar múltiples medicamentos, a múltiples concentraciones, en múltiples réplicas, y en los estudios o diagnósticos que involucran subpoblaciones definidas de células inmunes humanas.

Los científicos médicos del Hospital Universitario de Hamburgo-Eppendorf (Hamburgo, Alemania) utilizaron células de un cultivo primario derivado de un neurofibroma plexiforme benigno, una línea celular de melanoma y una línea de fibroblastos humanos. Las células se sembraron en pozos de placas de 96 pozos con diferentes concentraciones, cada una en tres repeticiones. Las placas se incubaron durante la noche para que las células se adhirieran a la superficie del cultivo y se sometieron a extracción de ADN al día siguiente después de comprobar las células vivas adhesivas, al microscopio.

Después de retirar el medio, los pozos se lavaron dos veces con PBS. Posteriormente, se añadieron 70 μL del reactivo de lisis de PCR directa (PeqLab, Erlangen, Alemania) suplementado con 0,2 mg/mL de proteinasa K fresca junto con 70 μL de agua a cada pozo que contenía células vivas adhesivas. Los sobrenadantes que contenían el ADN extraído se purificaron adicionalmente mediante precipitación. El equipo también lisó células usando polvo chelex100 (Bio-Rad, Hércules, CA, EUA). La reacción en cadena de la polimerasa convencional (PCR) se realizó con 2 µL de los 10 µl de ADN y un par de cebadores para un exón del gen NF1 que se usa para el diagnóstico genético de rutina en su laboratorio.

Los investigadores informaron que, para 1000 células de un cultivo primario y dos líneas de células tumorales, el ADN era reproducible y se obtuvo con una tasa de recuperación (cantidad obtenida/esperada de ADN) en el rango del 50% al 90%, según lo medido por el instrumento de colorantes fluorométricos, Qubit (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA). Para la PCR digital, se obtuvieron más de 1.600 gotas positivas para el análisis de ADN a partir de 1.000 células mediante el método de Direct PCR, lo que corresponde a una eficiencia de rendimiento de aproximadamente el 80%. Sería posible reducir aún más el número de células hasta 100 con 160 gotas positivas esperadas. Ambos reactivos son económicos a 8 centavos de euro/muestra.

Los autores concluyeron que los dos métodos eran eficientes; especialmente el método Direct PCR, basado en reactivos, proporciona un método simple y económico para preparar ADN adecuado para una PCR digital a partir de un número reducido de células. El estudio fue publicado el 5 de agosto de 2020 en la revista Journal of Clinical Laboratory Analysis.

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Hospital Universitario de Hamburgo-Eppendorf
PeqLab
Thermo Fisher Scientific