Análisis inmuno-CRISPR ayuda a diagnosticar el rechazo temprano del trasplante de riñón

Cuando un paciente recibe un trasplante de riñón, los médicos lo controlan cuidadosamente en busca de signos de rechazo de varias maneras, incluida la biopsia. Sin embargo, este procedimiento es invasivo y solo puede detectar problemas en una etapa tardía.

Los receptores de trasplantes de riñón deben tomar medicamentos inmunosupresores por el resto de sus vidas para ayudar a evitar que su sistema inmunológico ataque el órgano extraño. Sin embargo, a pesar de ello, el rechazo del riñón aún puede ocurrir, particularmente en los primeros meses después del trasplante, lo que se conoce como rechazo agudo. Los signos incluyen niveles elevados de creatinina sérica y síntomas como dolor renal y fiebre.

Los ingenieros biomédicos del Instituto Politécnico Rensselaer (Troy, NY, EUA), desarrollaron un ensayo basado en CRISPR que puede detectar de forma sensible y no invasiva un biomarcador de rechazo renal agudo en la orina. La detección basada en CRISPR de ADN o ARN objetivo explota una función dual, que incluye el reconocimiento específico de la secuencia objetivo, seguido de la actividad de transescisión de un conector colateral de ADN de cadena única (ssADN) entre un fluoróforo (F) y un extintor (Q), que amplifica una señal fluorescente tras la escisión.

Para establecer el ensayo “inmuno-CRISPR”, los científicos utilizaron conjugados de código de barras de anticuerpos anti-CXCL9-ADN para apuntar a CXCL9 y amplificar las señales fluorescentes a través de la actividad de escisión trans basada en Cas12a de los sustratos indicadores de FQ, respectivamente y, en ausencia de un paso de amplificación isotérmico. Para mejorar la sensibilidad de detección, el sistema de código de barras de ADN se diseñó mediante la introducción de múltiples sitios de reconocimiento Cas12a. El uso de códigos de barras de ADN biotinilado permitió el autoensamblaje en estreptavidina (SA) para generar complejos de código de barras SA-ADN y aumentar el número y la densidad de los sitios de reconocimiento Cas12a unidos al anticuerpo anti-CXCL9 biotinilado.

Los investigadores mejoraron la tasa de detección de CXCL9 aproximadamente 8 veces, en comparación con el uso de un código de barras de ADN monomérico. El límite de detección (LOD) para CXCL9 utilizando el ensayo inmuno-CRISPR fue de 14 pg/mL, lo que representó una mejora de ~7 veces en comparación con el ELISA tradicional basado en peroxidasa de rábano picante. La selectividad se mostró con una falta de reactividad cruzada con la quimioquina relacionada CXCL1. Finalmente, evaluaron con éxito la presencia de CXCL9 en muestras de orina de 11 receptores de trasplantes de riñón mediante el ensayo inmuno-CRISPR, lo que dio como resultado una exactitud del 100 % en la determinación clínica de CXCL9 y allanó el camino para su uso como biomarcador no invasivo en el punto de atención para la detección de rechazo de trasplante renal.

Los autores concluyeron que, a diferencia de otros métodos de detección basados en CRISPR, no se requiere amplificación por PCR, lo que hace que el método sea más fácil de adaptar a un dispositivo que se podría usar en el consultorio de un médico o incluso en el hogar de un paciente. El estudio fue publicado el 4 de diciembre de 2021 en la revista Analytical Chemistry.

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Instituto Politécnico Rensselaer