Análisis rápido CRISPR/Cas para el diagnóstico de fiebres virales en ambientes de baja tecnología

Las pruebas de diagnóstico rápido para los virus de la fiebre del Ébola y Lassa, basadas en el complejo CRISPR/Cas13a, dirigidas a la detección del ARN, se han probado con éxito en condiciones de campo en varios países africanos.

COVID-19 no es la única enfermedad que existe. Los recientes brotes de fiebres hemorrágicas virales (VHF), incluida la enfermedad por el virus del Ébola (EVE) y la fiebre de Lassa (LF), ponen de relieve la necesidad urgente de realizar pruebas sensibles y desplegables para diagnosticar estas devastadoras enfermedades humanas. En este sentido, los investigadores del Instituto Broad de MIT y Harvard (Cambridge, MA, EUA) y sus colaboradores, desarrollaron diagnósticos basados en CRISPR-Cas13a, dirigidos al virus del Ébola (EBOV) y al virus Lassa (LASV), con lecturas de flujo lateral y fluorescentes.

Los CRISPR (repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas) son segmentos de ADN procariótico que contienen repeticiones cortas de secuencias de bases. A cada repetición le siguen segmentos cortos de “ADN espaciador” de exposiciones anteriores a un virus bacteriano o plásmido. Desde 2013, se ha utilizado el sistema CRISPR/Cas9 en la investigación para la edición de genes (agregar, interrumpir o cambiar la secuencia de genes específicos) y la regulación de genes. Al administrar la enzima Cas9 y los ARN guía apropiados (ARNsg) a una célula, el genoma del organismo se puede cortar en cualquier ubicación deseada.

Los recientes esfuerzos computacionales para identificar nuevos sistemas CRISPR descubrieron un nuevo tipo de enzima dirigida al ARN, Cas13. La diversa familia Cas13 contiene al menos cuatro subtipos conocidos, incluidos Cas13a (anteriormente C2c2), Cas13b, Cas13c y Cas13d. Se demostró que Cas13a se une y escinde el ARN, protegiendo a las bacterias de los fagos de ARN y sirviendo como una plataforma poderosa para la manipulación del ARN. Se sugirió que Cas13a podría funcionar como parte de un sistema CRISPR/Cas versátil, guiado por ARN, dirigido a la detección del ARN, que tiene un gran potencial para aplicaciones precisas, robustas y escalables, guiadas por ARN dirigidas a la detección de ARN.

En el desarrollo de un método para diagnósticos desplegables y rápidamente adaptables, los investigadores trabajaron con la plataforma SHERLOCK (siglas en inglés para Desbloqueo de Reportero Enzimático Específico de Alta Sensibilidad), basada en CRISPR. SHERLOCK utiliza la proteína Cas13a dirigida al ARN para la detección sensible y específica del ácido nucleico viral. Este método funciona amplificando secuencias genéticas y programando una molécula CRISPR para detectar la presencia de una firma genética específica en una muestra, que también puede ser cuantificada. Cuando encuentra esas firmas, la enzima CRISPR se activa y libera una señal robusta. Esta señal se puede adaptar para trabajar en una simple tira de papel, en un equipo de laboratorio o para proporcionar una lectura electroquímica que se puede leer con un teléfono móvil.

SHERLOCK se puede combinar con el método HUDSON (Calentamiento de Muestras de Diagnóstico no Extraídas para Eliminar Nucleasas), que inactiva patógenos y libera ácido nucleico mediante una desnaturalización química y térmica combinada, eliminando la necesidad de una extracción de ácidos nucleicos basada en columna o en perlas. Este proceso hace que las muestras de los pacientes sean más seguras para que el personal clínico las manipule en entornos de baja tecnología y elimina la necesidad de extraer el material genético de un virus de las muestras, antes del análisis.

Para completar el paquete, los investigadores también desarrollaron una aplicación para teléfonos móviles llamada HandLens, que puede leer e informar inmediatamente los resultados de las tiras de papel SHERLOCK. Esta herramienta puede ayudar en situaciones en las que la tira de papel emite una señal débil que es difícil de interpretar para un médico.

Los investigadores utilizaron la técnica SHERLOCK junto con HUDSON y HandLens en Nigeria durante un reciente brote de fiebre de Lassa y en Sierra Leona y la República Democrática del Congo durante los brotes del virus del Ébola. Los resultados revelaron que los ensayos SHERLOCK funcionaron de manera tan consistente o mejor que otras metodologías de diagnóstico, lo que demuestra el potencial de la plataforma para el uso clínico en áreas con recursos limitados.

La técnica SHERLOCK para el diagnóstico rápido de enfermedades virales se describió en la edición en línea del 17 de agosto de 2020 de la revista Nature Communications.

Enlace relacionado:
Instituto Broad de MIT y Harvard