Secuenciación profunda de células CD34+ detecta enfermedad residual medible en la LMA

El seguimiento de la enfermedad residual medible (ERM) en pacientes con leucemia mieloide aguda predice la recurrencia de la enfermedad y puede identificar a los pacientes que se benefician de la intensificación del tratamiento. Las técnicas actuales de ERM se basan en métodos moleculares o de citometría de flujo multicolor, pero su aplicabilidad o sensibilidad son limitadas.

Para los pacientes con neoplasias hematológicas como la leucemia mieloide aguda (LMA) o el síndrome mielodisplásico de alto riesgo (SMD), la aplicación de trasplante alogénico de células madre (aloHSCT) sigue siendo a menudo la única opción de tratamiento curativo. Sin embargo, la recaída después del trasplante de células madre ocurre en 30 a 70 % de los pacientes con LMA y es la principal causa de fracaso del tratamiento, con un pronóstico sombrío y una supervivencia a dos años de <20 %.

Imagen: El clasificador de células BD FACSAria III está equipado con 4 láseres y el instrumento permite el análisis multicolor de hasta 15 parámetros (Fotografía cortesía de BD Biosciences)

Los hematólogos del Hospital Universitario Carl Gustav Carus TU Dresden (Dresden, Alemania) y sus colegas, analizaron retrospectivamente 429 muestras de sangre periférica (SP) y 55 de médula ósea (MO) de 40 pacientes con LMA y SMD de alto riesgo, con/sin recaída molecular según el quimerismo de donantes CD34+ (QD), en remisión completa después del aloTPH. El equipo evaluó la viabilidad de un enfoque novedoso para la detección de ERM en SP, que combina el enriquecimiento previo inmunomagnético y la clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) para el aislamiento de células CD34+ con secuenciación dirigida de próxima generación (NGS) con reducción de errores.

El equipo aisló células CD34+/CD117+ de células mononucleares (MNC) utilizando clasificación de células activadas por imán (MACS) por selección positiva usando el Kit Microbead CD34+ o el CD117+ (Miltenyi Biotec, Bergisch-Gladbach, Alemania). Para la clasificación FACS de células CD34+/CD117+, las fracciones enriquecidas con CD34 o CD117 se incubaron con los anticuerpos monoclonales CD45 FITC/CD34 PE (BD Biosciences, San José, CA, EUA). A continuación, se llevó a cabo la clasificación de las células CD34+/CD117+ en un clasificador de células BD FACS Aria II, con el objetivo de obtener entre 5.000 y 10.000 células CD34+/CD117+ y una pureza >90 %. Para la extracción de ADN, se usó el Mini Kit Sangre QIAamp DNA (Qiagen, Hilden, Alemania) o el “ZR 168 Viral DNA Kit” (Zymo Research, Orange, CA, EUA) con el fin de realizar los recuentos de células CD34+/CD117+.

Los investigadores informaron que el enriquecimiento de células CD34+ para NGS aumentó la detección de alelos mutantes en la SP ~1000 veces (mediana de frecuencia alélica variante [VAF] 1,27 % frente a 0,0046 % en SP sin clasificar). Aunque se observó una fuerte correlación para el análisis paralelo de células SP CD34+ con NGS y QD, la combinación de FACS y NGS mejoró la sensibilidad para la detección de ERM en estudios de dilución ~10 veces a niveles de 10-6. En ambos ensayos, la detección de ERM fue superior usando SP versus MO para el enriquecimiento de CD34+. Es importante destacar que la NGS en células CD34+ de SP permitió la predicción de la recaída molecular con alta sensibilidad (100 %) y especificidad (91 %), y significativamente antes (mediana de 48 días, rango de 0 a 281) que con CD34+ QD o NGS de SP sin clasificar, proporcionando tiempo adicional para la intervención terapéutica. Además, la secuenciación del panel en células CD34+ permitió la evaluación temprana de trayectorias clonales en remisión hematológica completa.

Los autores han propuesto un método novedoso, robusto y de fácil acceso para la detección ultrasensible de ERM en sangre periférica, que es aplicable a la gran mayoría de los pacientes con LMA. Los primeros resultados demuestran la viabilidad de la secuenciación profunda dirigida en células CD34+ para la predicción temprana de recaídas en entornos clínicos, con sensibilidad y especificidad superiores en comparación con la evaluación de ERM basada en quimerismo o el uso de sangre periférica sin clasificar para NGS. El estudio se publicó el 23 de marzo de 2022 en la revista Blood Advances.

Enlaces relacionados:
Hospital Universitario Carl Gustav Carus TU Dresden
Miltenyi Biotec
BD Biosciences
Qiagen
Zymo Research