Biopsia líquida para el diagnóstico del glioma pediátrico de alto grado

Se ha utilizado un método de biopsia líquida que detecta ADN tumoral libre de células (tADNcf) en muestras de líquido cefalorraquídeo para diagnosticar el glioma pediátrico de alto grado (pHGG, por sus siglas en inglés), un cáncer cerebral infantil poco común pero generalmente fatal.

Los tumores liberan ADN tumoral libre de células (tADNcf) en el líquido cefalorraquídeo (LCR), lo que permite la detección potencial de mutaciones asociadas al tumor mediante el análisis de LCR. Hasta ahora, la biopsia líquida ha sido particularmente desafiante para los tumores cerebrales porque el ADN mutante se elimina en los fluidos corporales en niveles mucho más bajos que en cualquier otro tipo de tumor.


Investigadores de la Universidad de Michigan (Ann Arbor, EUA) plantearon la hipótesis de que el análisis electrónico directo de tADNcf con una plataforma analítica portátil, el MinION de Oxford Nanopore Technologies (Oxford, Reino Unido), podría cuantificar la fracción alélica variante (VAF) de tADNcf en el LCR, específica del paciente con una velocidad y un límite de detección mejorados en comparación con los métodos establecidos.

La secuenciación de nanoporos es una tecnología única y escalable que permite el análisis directo en tiempo real de fragmentos de ADN o ARN. Funciona monitoreando los cambios en una corriente eléctrica cuando los ácidos nucleicos pasan a través de un nanoporo de proteínas. La señal resultante se decodifica para proporcionar la secuencia de ADN o ARN específica. Mediante la secuenciación de nanoporos se puede secuenciar una sola molécula de ADN o ARN, sin necesidad de amplificación por PCR o etiquetado químico de la muestra.

Para probar su hipótesis, los investigadores realizaron una amplificación por PCR de fragmentos ultracortos (100-200 pares de bases) de tADNcf para detectar alteraciones clínicamente procesables en muestras de LCR y tumores de 12 pacientes con pHGG junto con seis muestras de LCR de pacientes control sin tumores. A los productos de PCR les realizaron una secuenciación rápida basada en amplicones en el instrumento Oxford Nanopore MinION con cuantificación de VAF. Se realizaron comparaciones adicionales con la secuenciación de próxima generación (NGS) y la PCR digital por gotitas (ddPCR).

Los resultados revelaron que el instrumento Nanopore, que requiere cantidades significativamente menores de líquido cefalorraquídeo que otros métodos de secuenciación, demostró una sensibilidad del 85% y una especificidad del 100% en muestras de LCR (n = 127 réplicas) con un límite de detección de ADN de 0,1 femtomoles y resultados en 12 horas, todo lo cual se compara favorablemente con la NGS. La secuenciación en serie del tADNcf en el LCR por Nanopore, demostró la correlación de la respuesta radiológica en un ensayo clínico, con un paciente que mostró una respuesta molecular multigénica espectacular que predijo una respuesta clínica a largo plazo.

Los resultados obtenidos por este estudio confirmaron que la secuenciación mediante Nanopore de fragmentos ultracortos de tADNcf en el LCR de pacientes con pHGG era factible, eficiente y sensible con muestras de baja entrada, superando así muchas de las barreras que restringen el uso más amplio del diagnóstico y monitoreo del tADNcf en el LCR.

“Sabíamos por investigaciones anteriores que las secuencias genéticas de estos tumores, incluida la información sobre las mutaciones que los impulsan, se pueden encontrar en el líquido cefalorraquídeo, pero su recolección no es actualmente parte del estándar de atención”, dijo el autor principal, el Dr. Carl Koschmann, oncólogo pediatra de la Universidad de Michigan. “Eso es algo que queremos cambiar”.

“Como cuidadores, estamos entusiasmados con la posibilidad de monitorear tumores sin exponer a los pacientes a posibles complicaciones de cirugías invasivas”, dijo el Dr. Koschmann. “Este método sugiere que podemos detectar de manera rápida y confiable mutaciones clave, promotoras en los gliomas de alto grado con muestras muy pequeñas, superando algunas de las barreras que impedían el uso de líquido cefalorraquídeo para diagnosticar y monitorear a estos pacientes. Y somos optimistas sobre la incorporación de este método en el diseño de ensayos clínicos para el cáncer de cerebro pediátrico, lo que nos permite rastrear la respuesta molecular en múltiples genes para comprender y predecir mejor los resultados clínicos”.

El estudio fue publicado en la edición en línea del 21 de octubre de 2020 de la revista Clinical Cancer Research.

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Universidad de Michigan
Oxford Nanopore Technologies