Secuenciación profunda de células CD34+ detecta enfermedad residual medible en la LMA

Por el equipo editorial de LabMedica en español
Actualizado el 06 Apr 2022

El seguimiento de la enfermedad residual medible (ERM) en pacientes con leucemia mieloide aguda predice la recurrencia de la enfermedad y puede identificar a los pacientes que se benefician de la intensificación del tratamiento. Las técnicas actuales de ERM se basan en métodos moleculares o de citometría de flujo multicolor, pero su aplicabilidad o sensibilidad son limitadas.

Para los pacientes con neoplasias hematológicas como la leucemia mieloide aguda (LMA) o el síndrome mielodisplásico de alto riesgo (SMD), la aplicación de trasplante alogénico de células madre (aloHSCT) sigue siendo a menudo la única opción de tratamiento curativo. Sin embargo, la recaída después del trasplante de células madre ocurre en 30 a 70 % de los pacientes con LMA y es la principal causa de fracaso del tratamiento, con un pronóstico sombrío y una supervivencia a dos años de <20 %.


Imagen: El clasificador de células BD FACSAria III está equipado con 4 láseres y el instrumento permite el análisis multicolor de hasta 15 parámetros (Fotografía cortesía de BD Biosciences)

Los hematólogos del Hospital Universitario Carl Gustav Carus TU Dresden (Dresden, Alemania) y sus colegas, analizaron retrospectivamente 429 muestras de sangre periférica (SP) y 55 de médula ósea (MO) de 40 pacientes con LMA y SMD de alto riesgo, con/sin recaída molecular según el quimerismo de donantes CD34+ (QD), en remisión completa después del aloTPH. El equipo evaluó la viabilidad de un enfoque novedoso para la detección de ERM en SP, que combina el enriquecimiento previo inmunomagnético y la clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) para el aislamiento de células CD34+ con secuenciación dirigida de próxima generación (NGS) con reducción de errores.

El equipo aisló células CD34+/CD117+ de células mononucleares (MNC) utilizando clasificación de células activadas por imán (MACS) por selección positiva usando el Kit Microbead CD34+ o el CD117+ (Miltenyi Biotec, Bergisch-Gladbach, Alemania). Para la clasificación FACS de células CD34+/CD117+, las fracciones enriquecidas con CD34 o CD117 se incubaron con los anticuerpos monoclonales CD45 FITC/CD34 PE (BD Biosciences, San José, CA, EUA). A continuación, se llevó a cabo la clasificación de las células CD34+/CD117+ en un clasificador de células BD FACS Aria II, con el objetivo de obtener entre 5.000 y 10.000 células CD34+/CD117+ y una pureza >90 %. Para la extracción de ADN, se usó el Mini Kit Sangre QIAamp DNA (Qiagen, Hilden, Alemania) o el “ZR 168 Viral DNA Kit” (Zymo Research, Orange, CA, EUA) con el fin de realizar los recuentos de células CD34+/CD117+.

Los investigadores informaron que el enriquecimiento de células CD34+ para NGS aumentó la detección de alelos mutantes en la SP ~1000 veces (mediana de frecuencia alélica variante [VAF] 1,27 % frente a 0,0046 % en SP sin clasificar). Aunque se observó una fuerte correlación para el análisis paralelo de células SP CD34+ con NGS y QD, la combinación de FACS y NGS mejoró la sensibilidad para la detección de ERM en estudios de dilución ~10 veces a niveles de 10-6. En ambos ensayos, la detección de ERM fue superior usando SP versus MO para el enriquecimiento de CD34+. Es importante destacar que la NGS en células CD34+ de SP permitió la predicción de la recaída molecular con alta sensibilidad (100 %) y especificidad (91 %), y significativamente antes (mediana de 48 días, rango de 0 a 281) que con CD34+ QD o NGS de SP sin clasificar, proporcionando tiempo adicional para la intervención terapéutica. Además, la secuenciación del panel en células CD34+ permitió la evaluación temprana de trayectorias clonales en remisión hematológica completa.

Los autores han propuesto un método novedoso, robusto y de fácil acceso para la detección ultrasensible de ERM en sangre periférica, que es aplicable a la gran mayoría de los pacientes con LMA. Los primeros resultados demuestran la viabilidad de la secuenciación profunda dirigida en células CD34+ para la predicción temprana de recaídas en entornos clínicos, con sensibilidad y especificidad superiores en comparación con la evaluación de ERM basada en quimerismo o el uso de sangre periférica sin clasificar para NGS. El estudio se publicó el 23 de marzo de 2022 en la revista Blood Advances.

Enlaces relacionados:
Hospital Universitario Carl Gustav Carus TU Dresden
Miltenyi Biotec
BD Biosciences
Qiagen
Zymo Research


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