Aplicación clínica de recuentos de leucocitos basados en análisis de metilación de ADN dirigido

Los subconjuntos de leucocitos generalmente se cuantifican con dispositivos automatizados de recuento de células y, en particular, para la estratificación de subconjuntos de linfocitos con citometría de flujo. A pesar de su amplia aplicación, los métodos convencionales tienen varias limitaciones.

La metilación del ADN (ADNm) es una modificación covalente de los residuos de citosina, principalmente en los dinucleótidos CG (sitios CpG). Al medir el nivel de metilación en los sitios CpG con hipometilación o hipermetilación específica del tipo de célula, es posible cuantificar la composición de los subconjuntos de leucocitos mediante algoritmos estadísticos (modelos de desconvolución).

Imagen: Instrumento PyroMark Q96 ID para el análisis cuantitativo de modificaciones genéticas o epigenéticas del ADN mediante la tecnología de pirosecuenciación (Fotografía cortesía de Karolinska Institutet)

Los ingenieros biomédicos de la Universidad RWTH Aachen (Aachen, Alemania) y sus colegas optimizaron y validaron los ensayos de ADNm dirigidos para la desconvolución de leucocitos utilizando 332 muestras de sangre venosa y 122 capilares de donantes sanos. Además, analizaron 36 muestras de pruebas de anillo y sangre venosa de 266 pacientes diagnosticados con diferentes enfermedades hematológicas. La deconvolución de los tipos de células se determinó con varios modelos utilizando valores de ADNm obtenidos mediante pirosecuenciación o PCR de gotitas digitales (ddPCR).

El ADN se aisló de 150 µL de sangre venosa o 50 µL de sangre capilar y se trató con bisulfito con el kit de metilación de ADN EZ (Zymo Research, Irvine, CA, EUA). Los amplicones de PCR se secuenciaron en un PyroMark Q96 ID (Qiagen, Hilden, Alemania) y se analizaron con PyroMark Q96 CpG 1.0.9 de Qiagen. La reacción en cadena de la polimerasa de gotitas digitales (ddPCR) se llevó a cabo con el lector digital de gotitas QX200 (Bio-Rad, Hercules, CA, EUA). También se realizó la cuantificación absoluta de leucocitos por pirosecuenciación.

Los investigadores informaron que la cuantificación relativa de leucocitos se correlacionó con los hemogramas convencionales para granulocitos, linfocitos, células B, células T (CD4 o CD8), células asesinas naturales y monocitos con mediciones de pirosecuenciación y ddPCR. En algunos pacientes, particularmente con neoplasias malignas hematopoyéticas, observaron valores atípicos en los recuentos de leucocitos epigenéticos, que podían discernirse si las proporciones relativas de los subconjuntos de leucocitos no sumaban el 100 %. Además, la cuantificación absoluta se obtuvo añadiendo muestras de sangre con un plásmido de referencia de número de copias conocido. Los resultados confirmaron la hipometilación específica del tipo de célula en los genes WDR20, CD4, CD8A, WIPI2, SLC15A4 y CENPA, que fue más pronunciada en comparación con los datos de Illumina BeadChip o la estimación inversa de mínimos cuadrados no negativos (NNLS).

Los autores concluyeron que el análisis de ADNm dirigido mediante pirosecuenciación o ddPCR es una alternativa válida para cuantificar subconjuntos de leucocitos, pero algunos ensayos requieren una mayor optimización. El estudio fue publicado el 14 de febrero de 2022 en la revista Clinical Chemistry.

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